293t細胞-英瀚斯(在線咨詢)-細胞
細胞實驗介紹——慢病毒建立穩轉細胞系
慢病毒包裝：公司使用3質粒慢病毒包裝系統，慢病毒系統使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，過表達慢病毒系統使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三質粒系統，流式細胞技術，將質粒混勻后使用*鈣轉染方法轉染至hek293t細胞中，培養48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化*盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。
滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293t細胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況。根據細胞熒光量計算病毒滴度。
細胞：在病毒*天對細胞進行計數，接種約10000個細胞于12孔板中，培養過夜后使用無培養基稀釋病毒，加入12孔板中對細胞進行，病毒數量根據推薦細胞的moi加入（若無推薦moi，需做病毒梯度：1，5，10，50，100 5個梯度對細胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養基細胞培養，培養48h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選，篩選約2周時間。細胞篩選好后，使用定量pcr和western blot檢測目的*的穩定表達情況。
實驗流程：慢病毒質粒構建-hek293t細胞培養-質粒轉染293t細胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測-細胞-穩轉細胞篩選-穩轉細胞鑒定
結果示例：
圖 a 病毒滴度檢測；b 目的細胞病毒效果圖
軟瓊脂培養克l隆形成試驗基本步驟:
(1)取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活l細胞計數，用含20%胎牛血l清的dmem培養液調整細胞密度至1x106細胞/l。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xdmem培養基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，流式細胞實驗，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10ml)，293t細胞，冷卻凝固，可作底層瓊脂置co2溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xdmem培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2ml的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%co2溫箱中培養10~14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞數。計算形成率。軟瓊脂培養法常用檢測腫l瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40日。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗。
軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克l隆)
將1.2%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，6孔板中每個孔1.4ml溫室凝固，取對數期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數，并調細胞濃度為10000個/ml，將0.6%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。置于37目，5%co2的細胞培養箱中培養2-3周，計數含50個細胞以上得克l隆，計算細胞集落形成率，spotll 采集圖像。
小鼠成骨細胞和*骨細胞共培養模型的建立
細胞之間的相互調控作用奠定基礎.方法利用24 h內新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長分別分離、培養成骨細胞和*骨細胞，細胞，采用間接接觸的培養模式將接種了骨sui單核細胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細胞的培養皿中進行共培養.共培養-定時間后進行* 骨細胞*酒石酸酸性*酶(tartrate-resistant acid phosphatase，trap染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一 步采用rt- pcr對*骨細胞標志酶*基質金屬蛋白酶.9(mmp-9)、trap 和組織蛋白酶k (cathepsin k )的表達進行檢測結果共培養5天后可觀trap( )多核細胞形成13天trap( )多核細胞數目達到高峰;骨吸收陷窩在共培養7天后開始出現，隨著培養時間的延長，陷窩面積呈增加趨勢;*骨細胞標志*trap在共培養3天時開始表達，而mmp-9和cathepsin k則在共培養5天后表達結論共培養體系中成骨細胞對*骨細胞調控作用顯著誘導的*骨細胞具有噬骨能力，該共培養模型可用于成骨細胞和*骨細胞之間的相互調控作用研究.
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